猪流行性腹泻诊断方法研究进展[研究材料].doc
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1、 猪流行性腹泻诊断方法研究进展【摘要】猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的乳猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要特征的急性接触性肠道传染病。由于与该病类似的肠道性传染病较多,所以仅通过临床症状和病理组织学变化很难做出准确的诊断。只有借助实验室诊断技术进行鉴别诊断才能作出确诊。随着对PEDV基因组分子生物学研究的不断深入,多种分子生物学诊断技术开始出现,本文针对该病现有的分子生物学诊断方法进行了阐述。【关键词】猪流行性腹泻;分子生物学;诊断;研究进展 Advan
2、ces in diagnostic methods porcine epidemic diarrheaAbstrct Porcine epidemic diarrhea is a piglet from porcine epidemic diarrhea virus causes vomiting, diarrhea and dehydration as acute intestinal infectious contact the main feature. Because the disease is similar to intestinal infectious diseases, w
3、hich is why only through clinical symptoms and pathological changes is difficult to make an accurate diagnosis. Only by means of laboratory diagnostic techniques in order to make the differential diagnosis confirmed. With the study of genomic molecular biology PEDV deepening variety of molecular bio
4、logy diagnostic techniques began to appear, the paper for the disease existing diagnostic methods of molecular biology are described.Key words Porcine epidemic diarrhea; Molecular Biology; Diagnosis; Progress advance 前言 猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus,
5、 PEDV)引起的一种严重的病毒性传染病。该病的特征是可以导致哺乳仔猪发生严重的腹泻、呕吐、脱水,并且致死率极高1。猪流行性腹泻(PED)在1971年在英国首次被报道,之后1978 年在日本、德国、比利时等地爆发。 在1976年,中国首次报道了该病。 在这之后的20年间,该病已经在我国的20多个省份爆发,给农民及养猪业造成了巨大的损失。在欧洲,猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的腹泻主要集中在架子猪、育肥猪及青年种猪。在我国,各年龄的猪都极易感染PEDV的猪群2。在寒冷季节,猪的病毒性腹泻主要由猪流行性腹泻病毒引起,保育与育肥猪的群的感染率较高于哺乳仔猪和母猪3。1.基因型 PEDV基因组是单股
6、正链RNA,与其他的冠状病毒具有相似性。PEDV基因组5端有一个帽子结构(cap),3端有一个Poly(A)尾。 现在已经测定了PEDV CV777株完整的基因组序列,大小为28 033 bp4。 目前除了人冠状病毒229E毒株(HCoV-229E)外,已知的其他冠状病毒成员都有Kozak序列,但是序列有所差异5。基因组序列包括6个ORF,从53依次为编码复制酶多聚蛋白lab、纤突蛋白、ORF3蛋白、小膜蛋白、膜糖蛋白和核衣壳蛋白的基因。在我国有不同于CV777疫苗株的新基因型的PEDV在流行,而他是否是CV777疫苗株的变异株, 还需要进一步的实验验证6。实验室诊断方法 PED在临床症状上与
7、猪传染性胃肠炎(TGE)极其相似,而通过临床症状很难鉴别出这两种病, 有时还会与猪轮状病毒共同感染。所以,通常用实验室诊断技术来检验是否是PEDV引起的腹泻。常用的实验室诊断技术有微量血清中和试验、免疫电镜法(immuno electron microscopy, IEM)、免疫荧光法(fluorescent antibody technique, FAT)、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、反转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-PCR, RT-PCR)等。下面介绍一下如今实验室经常检查的几种分子生物
8、技术:2.1 反转录-聚合酶链式反应 随着分子生物学的不断发展,关于PEDV的检测方法越来越受到广大研究学者的重视. RT-PCR技术也成为了检测PEDV的最有效的技术手段之一。国内外的研究人员已经在这方面进行了深入研究。2003年,吴凌等7利用RT-PCR扩增出854bp的PEDV M基因的全长片段, 以其为模板, 通过巢式反转录PCR(RT-nested PCR)扩增到412bp的M基因的部分片段。2010年,Ben Salem等8建立了检测猪肠道病毒的多重巢式PCR, 可以检测到PEDV的RNA浓度为27.2g/L, 证明了巢式PCR的敏感快速。2.2 荧光定量PCR 荧光定量PCR(F
9、luorescent QuantitativePCR,FQ-PCR) 技术是在普通PCR 反应体系中添加了荧光报告基因,通过描述荧光信号的积累情况使PCR 过程图像化,最后通过绘制出的标准曲线对目的片段进行量化的方法。随着PCR 反应的进行,产物不断累计,由此产生的荧光信号强度也成比例地增强。反应每进行一个循环,收集一次荧光强度信号,这样便可以通过荧光强度变化来反映产物量的变化。从而将荧光扩增曲线转换为产物增长曲线。PCR 定量的关键是如何选择指数扩增期和作为对照的内参基因。因为PCR的定量方法可以鉴定出细微的差异,所以荧光定量PCR 技术与常规的技术方法,如Southern、Northern
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