蛋白激酶A在TGF-β刺激增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成中作用.doc
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1、蛋白激酶A在TGF-1刺激增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成中作用 张选奋男,1965年生。兰州医学院副教授、副主任医师。现在第四军医大学西京医院整形外科中心从师李荟元教授和鲁开化教授攻读博士学位。已发表论文16篇。 摘要目的:探讨蛋白激酶A在TGF-1刺激增生性瘢痕和正常人皮肤成纤维细胞(HS-FB和NS-FB)合成胶原中的信号转导作用。方法:利用32P掺入底物法测定TGF-1刺激的HS-FB和NS-FB的PKA活性,3 H-脯氨酸掺入法和放射免疫法测定胶原合成能力。结果:NS-FB被TGF-1刺激后PKA的活性短暂升高后很快恢复,HS-FB则在3060min降低(P0.05)。TGF-1对两种细
2、胞有加速合成胶原的作用(30min后P0.05),HS-FB的合成能力比NS-FB强(刺激60min后P0.05)。cAMP有抑制作用(60min后P0.05),H7则有拟TGF-1作用(与对照比较时30min后P0.05),而H7可增强TGF-1刺激的作用(3060min时P0.05)。结论:TGF-1刺激两种细胞后PKA的活性变化提示cAMP/PKA通道参与介导TGF-1信号:TGF-1对HS-FB的短期刺激作用与PKA活性降低有关,但长期刺激作用与PKA通道活性变化无关;cAMP/PKA活化可以抑制FB合成胶原。关键词信号转导蛋白激酶A转化生长因子1成纤维细胞胶原合成 中图分类号R619
3、+.6文献标识码A文章编号1008-6455(2001)01-0009-04 THE EFFECTS OF ACTIVITY OF PROTEIN KINASE A IN TGF-1 STIMULATING COLLAGEN SYNTHESIS OF NORMAL SKIN AND HYPERTROPHIC SCAR FIBROBLASTS ZHANG Xuan-fenLU Kai-huaLI Hui-yuan et al Center of Plastic Surgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University.(Xian,Sha
4、nxi 710032) AbstractObjective:To investigate the effects of protein kinase A(PKA)in TGF-1 stimulating collagen synthesis of normal skin and hypertrophic scar fibroblast(NS-FB and HS-FB).Methods:The activity of PKA of HS-FB and NS-FB was detected by 32P incorporation assay.Total collagen synthesis wa
5、s measured by 3H-proline incorporation assay and radioimmunoassay.Results:The activity of PKA of NS-FB rose temporarily insigmificantly and recovered soon while the ones of HS-FB decreased and recovered at lh the stimulation of TGF-1(P0.05).TGF-1 could enhance collagen synthesis of FB(P0.05 at stimu
6、lating 30 minutes later) but the effects were stronger in HS-FB(WTBXP0.05 at stimulating 60 minutes later).cAMP could inhibit the changes (P0.05 at stimulation 60 minutes) while H7 could improve roles of TGF-1(P0.05 at 3060minutes of stimulation).Conclusion:The changes of the PKA activity of the two
7、 types of cell after the stimulation of TGF-1 might implicate that there was difference in the PKA signal pathway.The effects of TGF-1 stimulating collagen synthesis might have partly relation to cAMP/PKA pathway but activating cAMP/PKA signal pathway could abrogate FB to synthesize collagen. Key wo
8、rdsSignal TransductionProtein Kinase ATGF-1FibroblastCollagen Synthesis 瘢痕增生是血管内皮细胞(Endothelial Cell,简称EC)1、血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,简称VSMC)2,3和成纤维细胞(Fibroblast简称FB)4等瘢痕形成相关细胞增埴加速和合成大量细胞外基质所致。转化生长因子1 (TGF-1)能强烈刺激FB、EC和VSMC等合成细胞外基质。而cAMP/PKA途径活化对许多细胞合成胶原等细胞外基质有抑制作用。先前我们研究了TGF-1刺激FB增殖中PKA所起
9、的作用5,本文的目的是研究TGF-1刺激增生性瘢痕和正常人皮肤成纤维细胞(Hypertrophic Scar Fibroblast,HS-FB和Normal Skin Fibroblast,NS-FB)合成胶原与PKA活性间的关系。 1材料和方法 1.1材料标本:增生性瘢痕(HS)和正常人皮肤组织(各4例)来自我院手术病例。二者在年龄、性别和部位等方面匹配。原代培养用组织块法。实验用410代细胞。试剂:leupeptin、aprotanin、H7和PMSF购自sigma公司。PKA检测kit、cAMP和TGF-1购自Promega公司。蛋白质定量kit购自Bio-RAD公司。3 H-脯氨酸购自
10、北京原子能研究院。-32 PATP(3000ci/m mol)购自北京亚辉生物公司。型前胶原测定试剂盒购自重庆肿瘤研究所。DMEM购自Hyclone公司。其它试剂均为分析纯或更纯。仪器:Beckman GS-15R冷冻高速离心机;Polytron 超声匀浆仪;Beckman LS6500液闪仪;Perkin Elmer Lambda14紫外可见光分光光度计等。 1.2方法 1.2.1PKA活性测定TGF-1刺激的时间为10、30、60和120min,按我们先前的方法5测定。 1.2.2胶原合成测定3 H-脯氨酸掺入实验:接种细胞2.5107/ml(10%胎牛血清的DMEM制备细胞悬液)于96孔
11、板,每孔100l,置于5%CO2,100%湿度,37培养48h。0.5%胎牛血清的DMEM饥饿细胞24h。分别用0.5%胎牛血清的DMEM稀释的TGF-15ng/ml、H7250M、cAMP0.025mM和TGF-15ng/ml+H7 250M刺激10、30、60和120min,0.5%胎牛血清的DMEM为阴性对照。刺激后吸弃上清液,直接加入100l3 H-脯氨酸5m ci/L(含维生素C 50mg/L、1-氨基丙腈100mg/L和10%胎牛血清的DMEM),培养24h,弃上清,消化细胞,多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维纸上,加闪烁液,液闪计数。此外,为了研究较长时间刺激的效应,我们还做了刺激
12、12h和24h的反应。上清液前型胶原(PC)测定:细胞培养和刺激与3 H-脯氨酸掺入实验相同。刺激后,10%胎牛血清的DMEM培养48h,小心吸取培养上清液,-20保存,两周内检测。检测时,于1.5ml离心管中加入上清液100l和人PC抗体200l,4放置20h,加125I-hPC100l,4放置6h,加分离剂(混匀后)200l,室温30min,1400g离心30min,吸弃上清液,沉淀物作放射计数。查标准曲线即可得到PC的浓度。 2结果 2.1PKA活性变化TGF-1刺激后PKA的活性变化见图1。TGF-1刺激NS-FB后PKA的活性短暂升高,30min内恢复,但P0.05;而HS-FB被刺
13、激后酶活性降低(3060min时P0.05),1h内恢复到对照水平。 图1TGF-1刺激HS-FB和NS-FB后PKA的活性变化 2.2胶原合成能力测定结果3 H-脯氨酸掺入结果:见图2和图3。TGF-1可增强两种细胞的胶原合成(30min后WTBXP0.05),TGF-1对HS-FB的刺激作用强于NS-FB(刺激60min后P0.05)。而cAMP则有抑制作用(60min后P0.05),H7有拟TGF-1作用(与TGF-1比较:P0.05,与对照比较:30min后WTBXP0.05),且H7可以部分增强TGF-1刺激的作用(3060min时P0.05)。TGF-1等作用后两种细胞合成胶原能力
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