肾素原受体系统在糖尿病视网膜病变中的作用.docx
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1、肾素原受体系统在糖尿病视网膜病变中的作用糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病性微血管病变中最常见的并发症,也是糖尿病最严重的并发症之一。糖尿病视网膜病变的病因复杂,至今发病机制不明。糖尿病视网膜病变主要以氧化作用造成视网膜的损伤,8-羟脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 -deoxyguanosine,8-OHdG) 可以标记氧化应激损伤,通过免疫组化法可以检测出 8-OHdG 的表达。研究1显示,肾素血管紧张素系统(rennin-angiotensin system,RAS)的激活是 DR 发生发展的风险因素,阻断 RAS 系统可以抑制糖尿病视网膜病变的发
2、展。慢性高血糖可以激活 RAS 在眼内发挥作用从而导致 DR 的进一步发展。血管紧张素是RAS 的主要效应分子,其通过收缩血管的作用强效升高全身和局部血压,研究2显示血管紧张素受体(angiotensin receptors2,AT2R)也存在于视网膜及其他眼内组织。肾素原受体(pro)rennin re-ceptor,PRR为 RAS 系统成员之一。细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)分为 ERK1 和 ERK2,统称为 ERK1/2,被激活后进入细胞核促进某些基因的转录和表达,与细胞的增殖分化有关。CD14 和 8-OHd
3、G 免疫组化染色了解新生血管的产生和视网膜神经细胞的凋亡的情况,该实验旨在通过观察不同病程糖尿病视网膜病变大鼠视网 膜 中 AT2R 的 含 量 以 及 ERK1/2、磷 酸 化ERK1 /2(p-ERK1 /2) 蛋白的表达及 CD14、8-OHdG的表达,了解 RAS 系统在糖尿病视网膜病变中的作用。1 材料与方法1. 1 实验动物 健康雄性 SD 大鼠 50 只,普通级,2 月龄,190 ± 20 g,由安徽医科大学实验动物中心提供,随机分为正常组(10 只)和糖尿病组(38 只)。实验期间各组大鼠均自由饮水和进食(普通饲料喂养)。1. 2 主要试剂及仪器 链脲佐菌素( s
4、treptozocin,STZ)购自美国 Sigma 公司;ERK1/2 单抗和兔抗磷酸化 ERK1/2 多抗购自美国 Santa Cruz 公司;TR-Izol、MMLV 购自美国 Gibco BRL 公司;内参 β-actin单抗购自武汉博士德公司;ECL 化学发光试剂盒购自美国 Pierce 公司。1. 3 糖尿病大鼠模型建立 适应性饲养 1 周,1 周后将(200 ±20) g 的 48 只大鼠作为研究对象,血糖检测均正常。依据文献3,大鼠一次性单剂量腹腔注射 STZ 50 mg/kg 溶于柠檬酸盐缓冲液中(临用前以1 1 混合柠檬酸与柠檬酸钠,pH 4. 5)
5、,对照组给予等剂量柠檬酸盐缓冲液;48 h 后采用罗氏血糖仪测定尾静脉血糖,血糖≥16. 9 mmol/L 认为糖尿病模型建立成功。模型建立后观察 1 周后测量血糖,将血糖稳定在 16. 9 mmol/L 以上作为糖尿病组,此时开始计算糖尿病鼠病程。1. 4 样本制备 于病程 4、8、12 周分别处死大鼠,对照组各 3 只及糖尿病组各 7 只,10% 水合氯醛麻醉,5 ml/kg,放血处死,取其双眼,快速在显微镜下冰上分离视网膜组织,EP 管冻存于 -80 ,2 只眼分开保存。1. 5 免疫组化染色 使用免疫组化三步法:石蜡切片脱蜡至水。3%H2O2室温孵育 5 10 min 以消除内源
6、性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗,PBS 浸泡2 次,每次 5 min.5% 10% 正常山羊血清( PBS 稀释)封闭,室温孵育 10 min,倾去血清,勿洗。滴加一抗工作液,37 孵育 1 2 h 或 4 过夜。PBS冲洗3 次,每次3 min.滴加适量生物素标记二抗工作液,37 孵育 30 min.PBS 冲洗 3 次,每次 5min.滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液,37 孵育 30 min.PBS 冲洗,3 次每次 5 min.DBA稀释 50 倍显色 10 min,自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。采用激光共聚焦显微镜进行观察,Image Pro Plus 6. 0 软件
7、分析图像,以上切片每组随机抽取 10 张切片进行光密度分析,记录每张片子的光密度(optical density,OD)值。1. 6 检测 AT2R 受体 mRNA 表达 由基因库查得大鼠 AT2R 的 mRNA 核苷酸序列,取视网膜组织100 mg,加液氮研碎后,用 TRIzol 提取总 RNA.实验组和对照组分别取1 μg 总 RNA 以 MMLV 为逆转录酶作逆转录反应。cDNA 产物保存于 -20 。优化扩增条件,使 PCR 扩增在对数期内进行。在 DNA扩增仪上进行 AT2R 的 PCR 扩增30 个循环。AT2R的退火温度为 62 。取 PCR 扩增产物 5 μl 在1
8、. 5% 琼脂糖中电泳,Imagemaster VDS 成像系统摄影存盘后应用计算机图像分析软件(TotallabV 1.01)行灰度扫描分析。以目的基因与 β-actin 的 PCR产物条带灰度体积之比作为反映目的基因 mRNA水平的相对指标。1. 7 ERK 信号通路检测 配 10% 的 Tris-甘氨酸SDS 聚丙烯酰胺胶,胶放入电泳槽,槽中加满 Tris-甘氨酸,样品孔中加样,电压积层胶 8 V/cm(40 60V),分离胶 18 V/cm(100 V),当溴酚蓝到底部停止,取出胶板,把分离胶放入转移缓冲液中平衡 10min,裁取适当大小的硝酸纤维素膜,放入转移缓冲液平衡 1
9、0 min.转膜,电压 110 V,1. 5 h;放入 5%脱脂奶粉的 TBS 封闭液中平衡 2. 5 h;滴加一抗,在室温下翻转摇床上作用 2 h,4 过夜;TBST 漂洗 3次,每次 15 min,滴加二抗,室温下翻转摇床上作用1 h;TBST 漂洗 3 次,每次 15 min;ECL 荧光显影液反应、曝光、显影和定影。β-action 为内参照,计算待测蛋白条带积分吸光度(integrated absorbance,IA)与β-action 的比值,表示待测蛋白的相对表达水平。1. 8 统计学处理 采用 SPSS 17. 0 软件进行分析,数据以 x珋 ±
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- 肾素原 受体 系统 糖尿病 视网膜 病变 中的 作用
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