肌球蛋白轻链的磷酸化研究综述.docx
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1、肌球蛋白轻链的磷酸化研究综述1 肌球蛋白的结构与功能肌球蛋白主要存在于平滑肌中, 它是肌原纤维粗丝的组成单位。 其分子形状如豆芽状,由多条重链与多条轻链组成。 肌球蛋白的家族较大,目前发现的肌球蛋白有 24 种,但依据其来源又可分为传统的肌球蛋白和非传统的肌球蛋白,如传统的肌球蛋白为肌肉的肌球蛋白,即肌球蛋白,但非肌肉细胞也存在肌球蛋白, 为非肌肉肌球蛋白; 非传统的肌球蛋白是指肌肉中不含有的肌球蛋白,如肌球蛋白、,只存在于非肌肉细胞中;肌球蛋白、和只存在于植物当中。此外,肌球蛋白在生物体内的作用是细胞运动,胞引作用和泡液收缩;骨骼肌肌球蛋白的作用是使骨骼肌肌肉收缩; 肌球蛋白主要功能是靶向小
2、包运输和 mRNA 的靶向运输1.在生物有机界中,利用化学能/化学势能进行机械做功的生物大分子,称为分子马达。 而肌球蛋白作为一种分子马达2,参与了肌肉收缩、趋化性胞质分裂、胞引作用、膜泡运输以及信号传导等活动1.目前研究得较多的是肌球蛋白, 其最早发现于动物细胞的肌肉组织和细胞质中, 形状如 Y;型,是一个六聚体的大分子蛋白质,包括两条相对分子质量约为 220 kD 的重链、两条约 17 kD的必须轻链和两条约 20 kD 的调节性轻链3. 根据重链在细胞内所起的作用, 按照结构和功能不同可划分为 3 个区域:1)位于重链的 N 末端形成一个球状的头部,含有一个肌动蛋白( actin) 结合
3、位点和 ATP 结合位点的催化区域,负责释放化学能;2)重链的 C 末端则形成一个细长的 α-螺旋状的尾部, 尾部结构域含有决定尾部是同膜结合还是同其他的尾部结合的位点;3)连接头尾的是 α-螺旋状的颈部,其与必须轻链、调钙素或类似钙调素的调节轻链相连, 颈部是起到水平臂作用的区域, 在这个区域中通过 ATP 水解将产生动力冲程,实现将化学能转化为机械能4.通过对各个物种的肌球蛋白重链, 轻链序列的功能结构域分别进行氨基酸水平上的多序列比对,结果发现肌球蛋白较为保守,只是个别氨基酸序列存在差异, 这表明各个物种肌球蛋白磷酸化的作用机制与功能大体一致( 图 1)。2 肌球
4、蛋白轻链的磷酸化由肌动蛋白-肌球蛋白(actin-myosin)相互作用介导的细胞收缩,对肌肉与非肌肉细胞的一些生理活动起着至关重要的作用,包括细胞分裂、粘连、趋化性和胞质分裂5,其动力学活性会调控细胞收缩,调节血管渗透性,控制平滑肌细胞中的血压6.2.1 肌球蛋白轻链磷酸化的作用机制。肌球蛋白( 平滑肌与非肌肉蛋白)受肌球蛋白轻链( MLC)磷酸化调控7.磷酸化的肌球蛋白是维持细胞骨架活性及细胞功能的重要效应因子8, 9.肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, ML-CK) 和 ROCK/ROK/Rho 激 酶 (Rho kinase, ROCK)是在体内和体
5、外使 MLC 磷酸化的两种重要激酶10.通常认为, 当 Ca2+与钙调蛋白复合体(Calmodulincomplexes,CaM)结合后,会激活 MLCK,进而 ML-CK 使 肌 球 蛋 白 轻 链 20 (myosin light chain 20,MLC20)上第 19 位的丝氨酸( Ser19)磷酸化,导致激活肌球蛋白头部的 Mg2+-ATP 酶(简称 ATP 酶)11,该酶水解 ATP 产生能量会使其构象发生转变,这种构象会使肌球蛋白去结合肌动蛋白( actin),利用ATP 形成一种细胞收缩的压力12. 相反地,用肌球蛋白轻链磷酸酶( (myosin light chain pho
6、sphatase,MLCP) 使 MLC 去磷酸化后会使构象弯曲,结合肌动蛋白的能力下降。 MLCP 是一个异源三聚体蛋白,由磷酸酶( PP1C)、肌动蛋白结合区和调节区域( MYPT) 以及一个 20 kD 的小亚基( ML20) 组成,但 ML20 的功能尚不清楚。MLC 的这种周期性的磷酸化与去磷酸化的状态, 是细胞发生运动和收缩的必备条件13.RhoA 的 效应分子 ROCK14是肌球蛋白磷酸化和调节肌球蛋白功能的另一个重要调节因子,它使肌球蛋白结合肌球蛋白磷酸酶( MLCP)的位点(MBS)磷酸化15,抑 制 MLCP 活 性 ,从而增加了肌球蛋白的磷酸化水平, 诱导 RhoA 介导
7、的应力纤维和粘着斑装配。在平滑肌和非肌细胞中,ROCK还能直接磷酸化 MLC 刺激肌球蛋白收缩16.对于所有的肌球蛋白, 大体机制都可以解释为当肌动蛋白结合到马达区域时, 马达运动由于在活性位点 ATP 诱导的构象发生变化引起 RD( 一种调控区域可以使必须轻链、调节轻链以及重链结合)旋转17. RD 包含着重链( heavy chain,HC)的一段较长的螺旋, 可以使调节轻链( regualatelight chain,RLC) 和 必须轻链( essential light chain,ELC) 以反向平行的方式结合。 轻链可以稳定 HC螺旋,然后作为一个较为自由的转换器,由一种构象转换
8、为另一种构象去产生工作的动力。2.2 肌球蛋白轻链磷酸化的主要生物学功能2.2.1 磷酸化对细胞迁移的调节Totsukawa 等在 2004 年将成纤维细胞作为研究材料发现,MLCK 与 ROCK 在调节 MLC 磷酸化时,在 MLC 所处的不同空间分布中起着不同的作用。 在细胞迁移中 MLCK 诱导细胞周边和前端肌球蛋白轻链磷酸化,ROCK 诱导细胞中心肌球蛋白轻链磷酸化。 肌球蛋白在细胞周边的磷酸化有两种功能:第一,阻止由肌动蛋白多聚化产生的突触,以便于细胞迁移;第二,位于细胞周边的肌球蛋白磷酸化对在运动细胞的前端装配成熟的粘附结构是必需的16.2.2.2 磷酸化对细胞收缩行为的影响肌球蛋
9、白产生的收缩力不仅为细胞的迁移提供动力,在维持细胞形态,促进伤口愈合,介导胞外基质和细胞信号转导中也起着重要的作用16.Beningo 等使用特异性抑制剂 blebbistain 处理后,发现抑制了肌球蛋白的收缩活动, 同时抑制ROCK 也会很大程度减少肌球蛋白的收缩18.2.2.3 磷酸化对细胞形态与凋亡的影响肌球蛋白的活性对于应力纤维粘着斑的形成是必需的。 ROCK 使肌球蛋白结合肌球蛋白磷酸酶( MLCP)的位点(MBS)磷酸化,抑制肌球蛋白磷酸酶活性,从而增加了肌球蛋白的磷酸化水平,诱导 RhoA 介导的应力纤维和粘着斑装配。 而且它还与整合素介导的一些信号通路相关16( 表 1) .
10、p114RhoGEF 是一种 RhoA 激活剂,能结合到肌球蛋白 IIA 上,并起到一定的调控作用19, 20,有数据显示,p114RhoGEF 能驱动上皮细胞的迁移,变形虫的运动以及肿瘤细胞的入侵21.2.3 肌球蛋白轻链磷酸化的最新研究成果2.3.1 β-抑制蛋白调控的磷酸化2013 年 Elie Simard 等通过利用兔子的骨骼肌,发现 β-抑制蛋白可以调控由血管紧张肽型1a 受体(AT1aR)刺激的肌球蛋白 MLC 的磷酸化。β-抑制蛋白属于抑制蛋白家族, 包括 β-抑 制蛋白-1 和 β-抑制蛋白-2, 它可以在哺乳动物组织中广泛表
11、达5. β-抑制蛋白介导 G 蛋白耦联受体和其他一些受体的信号通路的调控, 在细胞的生长、凋亡及免疫功能中都发挥了重要作用,并且与一些疾病的发病密切相关。 一些研究表明,β-抑制蛋白-1 对于激活 RhoA/ROCK 以及迫使形成肌纤 维 是 不 可 缺 失 的 . 一 些 G 蛋 白 偶 联 受 体( GPCRs),如血管紧张肽型 1a 受体( AT1aR),参与调控细胞收缩12.而 AT1aR 的拮抗剂( Ang)能够很好地防治血管收缩类的疾病22. 另外,ElieSimard 等利用酵母双杂交系统研究发现,由于β-抑制蛋白-1 的 163-253 位氨基酸包
12、含 MYPT-1的结合区域,所以 β-抑制蛋白-1 1-418 位氨基酸和 1-253 位氨基酸会与 MYPT-1 的 643-943 位氨基酸相互作用。 当受到 AT1aR 的刺激时,β-抑制蛋白-2 也会与 MYPT-1( 肌球蛋白调控区域)相结合。 通过 β-抑制蛋白诱导会激活 AT1aR 的信号通路,促进 MLC 的磷酸化,而 β-抑制蛋白-2/MYPT-1 复 合体会阻断到 MLCP 亚 基的入口 ,亲和性降低,所以 β-抑制蛋白-2 会使 MLC 去磷酸化。 周期性的 MLC 磷酸化会加速细胞收缩23.此研究表明,β-抑制
13、蛋白对于 MLC 的磷酸化与去磷酸化是不可缺失的,当肌肉细胞中缺失 β-抑制蛋白-1,在应对 AT1aR 的刺激下,MLC 的磷酸化水平会下降。经实验发现,这可能是基于两方面的原因: 其一是 MYPT-1 远离了 MLCP 的复合体;其二是依赖 β-抑制蛋白-1 的 RhoA 因子水平下降24,随后 ROCK 活性损失 ,MLCP 活性增强 ; 但当肌肉细胞中缺失 β-抑制蛋白-2, 在 AT1aR 的拮抗剂 Agonist 的刺激下, 会使 MLC 磷酸化水平升高。 有趣的是,两种 β-抑制蛋白会相互调控 MLC的磷酸化,缺失 β-抑制蛋白-
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