骨髓基质细胞的分离培养及其表面抗原测定与诱导分化.docx
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1、骨髓基质细胞的分离培养及其表面抗原测定与诱导分化骨髓基质细胞(BMSCs)是干细胞及处于不同分化阶段的前体细胞的混合物,具有自我更新能力及多向分化潜能。由于取材方便、创伤小,用于细胞移植和基因治疗有许多优势,具有很好的临床应用前景。由于骨髓中细胞成分比较混杂,BMSCs 在骨髓中含量极少,仅占骨髓中有核细胞的 0 001% 0 01%,实际应用中需对其进行体外分离纯化并大量扩增。2010 年12 月 2012 年5 月,我们对人BMSCs 进行分离培养,对培养细胞的表面抗原进行测定并诱导其向脂肪细胞、成骨细胞分化,为深入研究 BMSCs 的组织再生和修复提供实验基础。1 材料与方法1 1 材料
2、主要试剂:α-MEM 培养基、胎牛血清(FCS)购自美国 GIBCO 公司,细胞表面抗原检测试剂 CD45、CD90、CD29、CD14、CD105抗体及其阴性对照抗体购自美国 BD 公司。主要设备:CO2恒温培养箱(BB16/BB5060 Heraeus,德国),超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司),倒置相差显微镜(Nikon 801808,日本),正置显微镜( Nikon E600,日本),LDZS-2 低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂),Caliber 流式细胞仪(美国 BD 公司)。1 2 方法1 2 1 BMSCs获得和培养 骨髓来源:1 例 24 岁男性颅脑外
3、伤患者,无系统性疾病,术中用咬骨钳将损伤颅骨板障剪成 0 5 cm 直径的小块,置于无菌器皿中。BMSCs 培养:在无菌条件下取出颅骨,放入直径 120 mm 的培养皿;用无血清 α-MEM 培养基冲洗骨松质,将骨髓冲出;反复吹打含有骨髓的冲洗液,用 150 目铜网过滤;滤液以 1 000 r/min 离心 5min,弃上清。用含 10% FCS 的 α-MEM 培养基重悬细胞,反复吹打制成单细胞悬液,接种于培养瓶中。置于 37 、5% 的 CO2恒温培养箱中培养,72 h 后更换新鲜培养基,去除未贴壁细胞并继续培养,每 3 4 d 更换新鲜培养基。待原代培养的细胞生长
4、至80% 融合时,用 0 25% 胰蛋白酶消化进行传代培养,取第 3 代以后的细胞用于实验。1 2 2 体外培养BMSCs 的形态学观察 采用倒置相差显微镜,逐日观察细胞生长情况和形态特征。1 2 3 BMSCs表面抗原检测 采用直接免疫荧光染色流式细胞术,测定 BMSCs 表面抗原 CD45、CD90、CD29、CD14、CD105。1 2 4 诱导BMSCs 向脂肪细胞分化 取对数生长期的 BMSCs,以 5 × 103/ cm2接种于 6 孔板中,每孔内置 2 个高压灭菌盖玻片。分别各取 2 个 6 孔板作为实验组,2 个 6 孔板作为对照组。48 h 后,实验组更换脂肪诱导
5、培养基(1μmol/L 地塞米松、0 5mmol / L IBMX、10 μg / mL 牛胰岛素、100 μmol / L 消炎痛、10% FCS 的 α-MEM) 进行脂肪细胞分化诱导,每隔 3 d 换液 1 次。对照组更换常规培养液。诱导 3 周后,分别取出盖玻片进行油红 O 染色。油红 O 染色方法:细胞爬片用 PBS 洗 3 次,10% 中性甲醛固定 10 min,PBS 洗 3 次,油红 O 染液中浸染20 min,PBS 洗4 次,Mayer 苏木素(1 000 r/min 离心5 min 去杂质,取上清,用于染色) 复染 8 min,PBS 洗4
6、次,湿片,封片,显微镜下观察。1 2 5 诱导BMSCs 向成骨细胞分化 取对数生长期的BMSCs 以5 ×103/ cm2接种于6 孔板中。分别各取 2 个 6 孔板作为实验组,2 个 6 孔板作为对照组。48 h 后,实验组更换成骨诱导培养基(0 1μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L 抗坏血酸磷酸盐、10% FCS 的 α-MEM)进行成骨细胞诱导,每隔3 d 换液 1 次。对照组更换常规培养液。诱导3 周后,取出盖玻片进行 von Kossa 染色。von Kossa染色方法:10% 中性甲醛固定
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- 骨髓 基质 细胞 分离 培养 及其 表面抗原 测定 诱导 分化
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