实验碱性磷酸酶米氏常数的测定参考PPT.ppt
《实验碱性磷酸酶米氏常数的测定参考PPT.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《实验碱性磷酸酶米氏常数的测定参考PPT.ppt(26页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、1,实验五 碱性磷酸酶米氏常数的测定,2,一、目的要求,1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定原理和方法,测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。,3,二、原理,一、分光光度法的基本原理及方法 (一)利用吸收光谱对物质进行定性分析 1原理,4,2主要方法: (1)比较吸收光谱曲线 (2)比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm,核酸的最大吸收波长为260nm。 1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸,5,(3)比较吸光度的比值 纯DNA,6,(二)利用吸收光谱对物质进行定量分析 1原理 Beer-Lambert(
2、比尔)定律: T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL 其中:T为透光率;A为吸光率;I0为入射光强度;I为透射光强度; K为吸收系数;C为溶液浓度;L为溶液光程的厚度,7,2常用方法 (1)标准曲线法 OD或 浓度 标准曲线与样品的测定条件必须一致。,8,(2)标准管法 CX/AX=CS/AS,已知CS,测定AS、AX,可求得CX。 (3)摩尔吸光系数法 C=A/(为L=1cm,C为1 mol/L时的吸光系数,也称为摩尔吸光系数。,9,(三)米氏常数的测定原理,酶促反应v-S曲线 v S 推导出米氏方程为: 其中S为底物浓度;v为初速度;Vm为最大反应速度;Km 为米氏常数,1
3、0,米氏常数Km是酶的一个基本特征常数,它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时,米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm,可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式,即: 以1/v对1/S作图,可得一条直线,11,1/v 1/Vm -1/Km 1/S 本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm. 反应式:pNPP+H2O pNP+HPO42- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pNP的含量,求出反应速度v。,12,三、试剂与器材 试剂: 0
4、.5mol/mL pNP 、10 mmol/L pNPP、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸钠碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.1 mol/L NaOH、6 mg/mL碱性磷酸酶酶液 器材:恒温水浴锅、722分光光度计,13,四、分光光度计的使用,14,1722型分光光度计的外形,15,2.仪器操作键介绍 “方式设定”键(MODE):用于设置测试方式 “100%T/0ABS”键:用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”键:用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮:用于设置分析波长,16,3.样品测试操作 打开电源开关,使仪器预热20
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 实验 碱性磷酸酶 常数 测定 参考 PPT
链接地址:https://www.31doc.com/p-9288271.html